western blot(WB)的實驗步驟及注意事項
一.實驗步驟
1. 組織塊稱重
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊
3. 加入RIPA緩沖液（每克組織3 ml RIPA），PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron進一步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃
4. 加入PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分鐘
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g（約15,000轉(zhuǎn)）15分鐘
6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存
7. 進行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度
8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9. 沸水浴中3分鐘
10. 上樣
11. 電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA）
12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40分鐘）
13. 膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色
14. Westernblot 試劑盒顯色
15. 分析比較記錄
western blot的實驗步驟及注意事項的資料
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10. 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時。
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動。
注意事項：
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。
Western可以參考如下步驟進行操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海绫淘铺焐镌噭┑腤estern及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞
細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒
進行抽提，例如碧云天生物試劑的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。
收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要
采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生
產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒。
2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用碧云天生物試劑的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配
膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋
白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻資料配制，也可以使用碧云天生物試劑的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
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